Eine Einführung in die ELISA-Methode (Teil 1)

Einführung

Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISAs) gehören zu den am häufigsten verwendeten Wet-Lab-Proteomics-Assays, die heute verwendet werden. Der ELISA entstand aus einem älteren Assay-Design, dem Radiometric Immuno-Assay. Beim RIA werden radioaktive Reagenzien verwendet, die bei unsachgemäßer Handhabung ein erhebliches Risiko für die menschliche Gesundheit und Sicherheit darstellen. Die ersten ELISAs wurden entwickelt, um diese Gefahr zu umgehen und eine schnelle, einfache und sichere Alternative zu schaffen. RIAs werden zwar immer noch in einigen Zusammenhängen verwendet, sind aber weitgehend durch den sichereren, technisch weniger aufwendigen ELISA ersetzt worden. Wie sein Vorgänger ist auch der ELISA eine auf Antikörpern basierende Methode zum quantitativen oder qualitativen Nachweis eines bestimmten Analyten in einer Probe. Bei den mit der ELISA-Methode untersuchten Analyten handelt es sich in der Regel (aber nicht notwendigerweise) um Proteine, und die Probentypen können von rohen biologischen Flüssigkeiten (z. B. Plasma, Serum, Urin, Schweiß) bis hin zu verfeinerten Zellkulturmedien oder gereinigten rekombinanten Proteinen in Lösung reichen.

Es gibt zwar viele verschiedene Arten von ELISAs, aber das Grundprinzip des Tests ist verblüffend einfach: Antikörper, die mit einem Enzym (meist einer Peroxidase) konjugiert sind, werden an einen Analyten gebunden, der auf einem festen Träger (in der Regel eine 96-Well-Mikrotiterplatte) immobilisiert wurde. Die Probe wird gewaschen, und alle nicht gebundenen Antikörper werden abgespült. Dann wird ein farbloses chromogenes Substrat zugeführt, und das Enzymkonjugat katalysiert eine Reaktion, die das farblose Substrat in ein dunkel gefärbtes Derivat umwandelt. Die Farbveränderung wird verwendet, um das Vorhandensein des Analyten in einem qualitativen Assay zu bestätigen, und in einem quantitativen Assay kann das Ausmaß der kolorimetrischen Verschiebung mit der Verschiebung verglichen werden, die bei einem Satz bekannter Konzentrationsstandards beobachtet wurde, um die Menge des vorhandenen Analyten zu schätzen.

Ist ein ELISA der richtige Assay für mich?

Der ELISA ist als schnelles, einfaches und genaues Testverfahren bekannt, das entweder einen quantitativen oder qualitativen Nachweis des Analyten in einer Probe ermöglicht. Bei der Entscheidung, ob der ELISA für den beabsichtigten Zweck geeignet ist, sind einige Voraussetzungen zu berücksichtigen. Um für die Verwendung in einem ELISA in Frage zu kommen, sollten Analyt und Probe mindestens die folgenden grundlegenden Kriterien erfüllen:

• Der Analyt muss von einem Antikörper erkannt werden können.
• Der Analyt muss in einer wässrigen Probe mit einem angemessenen Volumen vorhanden sein. (In der Regel 50-200μL nach Verdünnung).
• Die Probe darf keine Substanz enthalten, die die Antigenerkennung oder den kolorimetrischen Nachweis stören könnte.
• Der Analyt muss in ausreichender Menge in der Probe vorhanden sein, um einen Nachweis zu ermöglichen.

Es ist nicht nur hilfreich zu wissen, welche Art von Proben mit ELISA kompatibel ist, sondern auch, welche Art von Proben mit dem ELISA-Format inkompatibel ist. Probentypen oder Analyten können aus einer Vielzahl technischer Gründe mit dem ELISA-Format inkompatibel sein. Im Folgenden sind einige Beispiele für Qualifikationen aufgeführt, die eine Probe in der Regel mit ELISA inkompatibel machen würden:

• Analyten, die nur in Spuren in einer Probe vorhanden sind.
• Analyten, für die die Herstellung von Antikörpern nicht trivial ist. (z. B. sehr kleine Moleküle)
• Proben, die Detergenzien, starke Säuren oder starke Basen enthalten.
• Proben, die dunkle Farbpigmente enthalten, die eine Mikrotiterplatte oder einen ähnlichen festen Träger verfärben können.

Der ELISA hat eine ganze Reihe von Vorteilen. Er ist ein schneller, skalierbarer und spezifischer Test, was ihn zu einem leistungsstarken und unverzichtbaren Werkzeug im Werkzeugkasten des Forschers macht. Die erzielten Ergebnisse können qualitativ, halbquantitativ oder vollständig quantitativ sein (abhängig von der Art des durchgeführten Tests). Die ELISA-Technik ist in ihrer Einfachheit äußerst genial. Sobald ein individueller Assay optimiert ist, kann ein wenig geschulter Techniker in der Regel zwischen 100 und 200 Proben über ELISA in nur wenigen Stunden analysieren. Standards und Proben werden in der Regel (zumindest) doppelt durchgeführt, was den ELISA zu einem recht robusten Test macht, der toleranter gegenüber Anwenderfehlern oder stochastischen Probenschwankungen ist als viele andere Methoden.

Dennoch ist der ELISA nicht ohne Einschränkungen. Die grundlegende Natur eines ELISA beschränkt einen einzelnen Test auf den Nachweis eines einzigen Targets. Da der Test von der Bindung des Analyten durch einen Antikörper abhängt, kann ein ELISA nicht zwischen antigenisch identischen Analyten (verschiedene Targets, die vom selben Antikörper erkannt werden) unterscheiden. So werden beispielsweise mit demselben ELISA-Assay oft viele oder alle verschiedenen Isoformen desselben Proteins in einer Probe erkannt. Für die ordnungsgemäße Durchführung des Tests sind außerdem einige spezielle Geräte erforderlich, wie z. B. ein spektrophotometrisches Mikroplatten-Lesegerät. Das ELISA-Format ist auch am kostengünstigsten, wenn viele Proben untersucht werden. Mit einem einzigen 96-Testset können in der Regel 40 Proben in doppelter Ausführung sowie eine Standardkurve mit 8 Proben untersucht werden. Viele Forscher finden die Kosten eines ELISA Kits für kleine Studien, die nur eine Handvoll Proben untersuchen, unerschwinglich.

Die mit ELISA verbundenen Hauptnachteile wurden durch den technischen Fortschritt weitgehend abgeschwächt. Heute verfügen die meisten akademischen und privaten Forschungseinrichtungen über die speziellen Plattenlesegeräte und andere Ausrüstungen, die für die Durchführung der verschiedenen Schritte eines ELISA erforderlich sind. Außerdem hat der Wettbewerb auf dem Markt die Preise für vorgefertigte ELISA-Kits gedrückt, und sie bieten im Allgemeinen ein besseres Preis-Leistungs-Verhältnis pro untersuchter Probe als viele andere gängige Proteomikmethoden. Dennoch sollte man die Wahl des Versuchsplans sorgfältig abwägen und die Stärken und Schwächen des ELISA-Formats gegen alle Optionen abwägen, wenn man die wichtige Entscheidung trifft, welche Techniken man einsetzen will.

Einen Assay bauen oder ein Kit kaufen?

Wenn Sie sich für einen ELISA entschieden haben, müssen Sie entscheiden, ob Sie ein im Handel erhältliches ELISA Kit verwenden oder versuchen, einen Assay von Grund auf selbst zusammenzustellen. Es gibt einige Gründe, warum man versuchen sollte, einen Test de novo zu erstellen, anstatt eine vorgefertigte Lösung zu kaufen. Wenn Sie eine Feinabstimmung Ihres Assays außerhalb der Spezifikationen eines kommerziell erhältlichen Kits benötigen, wenn Sie eine strenge Kontrolle über die spezifische Beschaffenheit der Komponenten benötigen, die in Ihren Assay eingehen, oder wenn Sie einen spezifischen oder benutzerdefinierten Antikörper in Ihrem Assay verwenden müssen, sollten Sie in Erwägung ziehen, die Zeit und den Aufwand zu investieren, die für die Erstellung eines Assays de novo erforderlich sind.

Wenn Sie jedoch nicht auf die oben genannten Kriterien beschränkt sind, sollten Sie der Einfachheit halber den Kauf eines kommerziell erhältlichen Assays in Betracht ziehen. Sie sollten den Kauf eines vorgefertigten Kits in Erwägung ziehen, wenn Sie dies wünschen:

• Zeit sparen: Die Optimierung von kundenspezifischen ELISA ist sehr zeitaufwändig. Selbst für einen erfahrenen Wissenschaftler mit kompatiblen Reagenzien erfordert ein neuer Test in der Regel Stunden oder Tage der Optimierung, bevor er einsatzbereit ist. Diese Zeit könnten Sie nutzen, um Ihre Daten zu sammeln, zu analysieren, zu interpretieren und zu veröffentlichen. Berücksichtigen Sie sorgfältig den Wert Ihrer Zeit und der Zeit der Techniker und Studenten, die den Assay entwickeln und durchführen werden.
• Kompatibilität der Reagenzien sicherstellen: Ein vorgefertigter ELISA Kit enthält garantiert Reagenzien, die miteinander kompatibel sind. Wenn Sie Ihren eigenen Test zusammenstellen, können Sie selbst bei der Auswahl hochwertiger Reagenzien versehentlich über inkompatible Produkte stolpern (z. B. zwei Antikörper, die ein ähnliches Epitop erkennen und sich aufgrund sterischer Hinderung gegenseitig blockieren).
• Vermeiden Sie frustrierende Probleme bei der Qualitätskontrolle: Wenn Sie einen Assay von Grund auf neu erstellen, müssen Sie wahrscheinlich verschiedene Reagenzien von verschiedenen Stellen beziehen. Und nachdem Sie die ganze Zeit damit verbracht haben, die verschiedenen benötigten Reagenzien ausfindig zu machen, könnte sogar ein einziger schlechter Puffer Ihr Experiment ruinieren und unzählige Stunden der Fehlersuche erfordern, um die Ursache des Problems zu finden. Im Gegensatz dazu ist jedes vorgefertigte ELISA Kit von antibodies-online durch unsere Geld-zurück-Garantie abgedeckt. Für den unwahrscheinlichen Fall, dass doch einmal ein Problem auftritt, kümmert sich unser technischer Support um die Fehlerbehebung.
• Geld sparen: Es mag zwar verlockend sein, einen ELISA selbst zusammenzustellen, um ein paar Euro zu sparen, aber die meisten Forscher stellen fest, dass die Kosten-Nutzen-Analyse am Ende nicht wirklich aufgeht. Wenn man all die verschiedenen Komponenten bedenkt, die gekauft werden müssen, um einen Test de novo zu erstellen, ist es oft genauso kosteneffektiv, ein vorgefertigtes Kit zu kaufen.

Unabhängig davon, ob Sie sich für den Kauf eines unserer gebrauchsfertigen ELISA Kits oder für die Entwicklung eines eigenen Tests entschieden haben, möchten Sie wahrscheinlich etwas mehr über die verschiedenen verfügbaren und gängigen Testdesigns erfahren. Um mehr über die verschiedenen ELISA-Formate zu erfahren, die bei antibodies-online erhältlich sind, lesen Sie bitte An Introduction to ELISA (Part 2).

Welche Vorteile bietet die Verwendung von ELISA Kits?

Um einen ELISA durchzuführen, benötigt man verschiedene Materialien. Eine vorbeschichtete 96-Well-Streifenplatte, mehrere Verdünnungsmittel, eine Stopplösung, einen Standard, gegen den getestet wird, ein Substrat, um die Farbreaktion zu erzeugen, Nachweisreagenzien und einen Waschpuffer. Dies spart Zeit im Vergleich zum Sammeln aller Materialien und zum Mischen der Lösungen vor jedem Assay. ELISA Kits sind eine bequeme Methode, um den gewünschten ELISA durchzuführen. Das Kit wird in einer Schachtel geliefert, die alle notwendigen Reagenzien auf einmal enthält - es muss nichts extra gekauft werden.

Save working time

The kit comes in a box containing all of the necessary reagents.

Ensure compatibility

Components are tested and have been proven compatible with each-other.

Avoid quality issues

Reagents of reliable quality: All products are covered by our money-back guarantee.

Save money

The cost-per-sample is generally lower than for de novo assay generation.

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