Protein Tags
Das grün fluoreszierende Protein (GFP) ist ein Protein aus der Qualle Aequorea victoria, das bei Anregung mit blauem oder ultraviolettem Licht grün fluoresziert. Die Entdeckung des grün fluoreszierenden Proteins in den frühen 1960er Jahren durch Shimomura hat den Grundstein für die moderne Bildgebung in lebenden Zellen gelegt. GFP kann mit anderen Proteinen von Interesse in einer Wirtszelle fusioniert werden und dient als nicht-invasiver fluoreszierender Marker in lebenden Zellen und Organismen.
Seitdem wurde GFP konstruiert und weiterentwickelt, um eine Vielzahl von Mutanten zu erzeugen, die eine breite Palette von Farben abdecken, einschließlich verstärkter grüner, cyanfarbener und gelber fluoreszierender Proteine, die Spitzenemissionswellenlängen im Bereich von 425 bis 525 nm aufweisen.
| Protein | Anregung [nm] | Emission [nm] | Extinct. Coeff. [M-1cm-1] | Quantenausbeute [Φ] | Helligkeit [nM-1cm-1] | t [0,5] Reifung (37 °C) | Struktur | Antikörper | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| GFP (wt) | 395 | 475 | 509 | 21.000 | 0,77 | 19.8 | 36 min | Dimer | ABIN100085 |
| EGFP | 484 | 507 | 56.000 | 0,6 | 33,6 | 15 min | Schwacher Dimer | ABIN1169226 | |
| EBFP | 383 | 445 | 29.000 | 0,31 | 6,9 | Schwacher Dimer | |||
| ECFP | 439 | 476 | 32.500 | 0,4 | 13 | Monomer | |||
| EYFP | 514 | 527 | 83.400 | 0,61 | 44,9 | 9 min | Schwacher Dimer | ||
Da sich die Konstruktion von rotverschobenen Mutanten aus dem GFP der Aequorea victoria-Qualle jenseits des gelben Spektrums als weitgehend erfolglos erwies, haben Forscher nach weiteren Möglichkeiten gesucht. Im Jahr 1999 wurde das rot fluoreszierende Protein DsRed, das aus Discosoma Seeanemonen stammt, in einer Publikation von Matz et al. erstmals erwähnt. Das Fluoreszenz-Emissionsspektrum von DsRed weist nach der Ausreifung einen Peak bei 583 nm auf, während das Anregungsspektrum einen Hauptpeak bei 558 nm und einen Nebenpeak um 500 nm aufweist.
Fluoreszierende Protein-Tags: GFP vs. RFP
Im Vergleich zu GFP weist der Wildtyp DsRed einige Nachteile, aber auch einige einzigartige Vorteile auf. Im Gegensatz zu GFP bleibt die Fluoreszenz von DsRed in sauren pH-Bereichen stabil. Außerdem ist DsRed aufgrund seines guten Kontrasts besonders gut für die Fluoreszenzmikroskopie geeignet. Zudem hat es eine hohe Quantenausbeute und ist photostabil. Andererseits erfolgt die Reifung der DsRed-Fluoreszenz langsam über einen Zeitraum von 24 Stunden. Daher kann es nicht zur Überwachung von Proteinen mit einer kurzen Halbwertszeit verwendet werden. DsRed ist ein obligates Tetramer und kann in lebenden Zellen große Proteinaggregate bilden, die ein höheres Risiko für Toxizität darstellen. Insgesamt kann GFP erfolgreich mit einer breiteren Palette von Proteinen konjugieren.
RFP-Varianten
Ähnlich wie bei GFP wurden mehrere RFP-Varianten entwickelt, um seine Eigenschaften im Allgemeinen zu verbessern oder für bestimmte Experimente zu optimieren. DsRed2 enthält mehrere Mutationen am N-Terminus, die die Bildung von Proteinaggregaten verhindern und die Toxizität reduzieren. Die rote Fluoreszenzemission von DsRed-Express kann innerhalb einer Stunde nach Expression beobachtet werden, 11-mal schneller als DsRed. DsRed-Express ist ein Vorläufer-RFP von neueren Derivaten wie tdTomato und den monomeren mCherry, mOrange und mStrawberry.
| Protein | Anregung [nm] | Emission [nm] | Extinct. Koeff. [M-1cm-1] | Quantenausbeute [Φ] | Helligkeit [nM-1cm-1] | t [0,5]Reifung (37 °C) | Struktur | Antikörper |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| DsRot | 558 | 583 | 75.000 | 0,68 | 49,3 | 26 h 40 min | Tetramer | ABIN129578 |
| DsRed2 | 563 | 582 | 43.800 | 0,55 | 28.6 | 6 h 30 min | Tetramer | ABIN129578 |
| DsRed-Express | 555 | 584 | 38.000 | 0,42 | 12,64 | 42 min | Tetramer | ABIN129578 |
| tdTomate | 554 | 584 | 138.000 | 0,69 | 95,22 | 1 h | Tandem-Dimer | ABIN6254170 |
| mCherry | 587 | 610 | 72.000 | 0,22 | 15.8 | 15 min | Monomer | ABIN1440058 |
| mOrange | 548 | 562 | 71.000 | 0,69 | 228 | 2 h 30 min | Monomer | |
| LSSmOrange | 437 | 572 | 52.000 | 0,45 | 23,4 | 2 h 20 min | Monomer |
mCherry ist zusammen mit mOrange und mStrawberry ein Mitglied der mFruits-Familie von monomeren rot fluoreszierenden Proteinen. Im Vergleich zum Vorläufer DsRed erzeugen mOrange, mStrawberry und mCherry stark blau- und rotverschobene Varianten. Sie haben ein geringeres Molekulargewicht und falten sich schneller als Tetramere und stören daher das Zielsystem weniger. Von allen entwickelten echten Monomeren hat mCherry die längste Wellenlänge, die höchste Photostabilität, die schnellste Reifung und eine exzellente pH-Beständigkeit. mOrange übertrifft mCherry in der Quantenausbeute, weist jedoch eine erhebliche Säureempfindlichkeit auf. Ein hoher Extinktionskoeffizient und eine hohe Quantenausbeute machen die Large-Stoke-Shift-Variante LSSmOrange (in Kombination mit T-Sapphire) zu einem geeigneten Kandidaten für FRET-Anwendungen.
tdTomato ist eine genetische Fusion aus zwei Kopien des dTomato-Gens, die speziell für eine geringe Aggregation entwickelt wurde. Seine Tandem-Dimer-Struktur spielt eine wichtige Rolle für die außergewöhnliche Helligkeit von tdTomato, die im Vergleich zu EGFP fünfmal höher ist. tdTomatos Emissionswellenlänge (581 nm) und Helligkeit machen es ideal für bildgebende Studien an lebenden Tieren. Da tdTomato ein intramolekulares Dimer bildet, verhält es sich wie ein Monomer und ist genauso photostabil wie mCherry.
Phototransformierbare fluoreszierende Proteine
Dendra2 ist eine verbesserte Version des grün-zu-rot-phototransformierbaren fluoreszierenden Proteins Dendra, das von der Oktokorallenart Dendronephthya stammt. Dendra2 zeigt eine schnellere Reifung und eine hellere Fluoreszenz sowohl vor als auch nach dem Photoswitching als die von Dendra. Im Gegensatz zu allen anderen monomeren photoaktivierbaren FPs, die notwendigerweise UV-violettes (z.B. 405 nm Laser) Licht zur Aktivierung benötigen, erlauben Dendra und Dendra2 die Verwendung von blauem (z.B. 488 nm Laser) Aktivierungslicht. Die phototransformative Eigenschaft hat die Markierung und Verfolgung von Subpopulationen von Zellen, Organellen und Proteinen in lebenden Systemen ermöglicht. Mit Dendra2 können neu synthetisierte Proteine, die sich auf dem Weg zu ihrem endgültigen Bestimmungsort befinden, sichtbar gemacht werden.
| Protein | Anregung [nm] | Emission [nm] | Extinct. Koeff. [M-1cm-1] | Quantenausbeute [Φ] | Helligkeit [nM-1cm-1] | t [0,5] Reifung (37 °C) | Struktur | Antikörper |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Dendra2 | 490 | 507 | 45.000 | 0,50 | 23 | Monomer | ABIN361314 | |
| 553 | 573 | 35.000 | 0,55 | 19 |
Protein-Tags sind verschiedene, meist kurze, Aminosäuresequenzen, die zur Markierung von Proteinen verwendet werden können. Das Tag wird mit Hilfe der Gentechnik an ein rekombinantes Protein fusioniert. Im Allgemeinen werden Protein-Tags zur Aufreinigung und Detektion mittels Affinitätschromatographie, Pull-Down-Assays, Western Blot, Immunhistochemie, Fluoreszenzmikroskopie oder im Live-Imaging eingesetzt. Tags haben aufgrund ihrer Struktur unterschiedliche Eigenschaften und darauf aufbauend auch unterschiedliche Anwendungsgebiete. Tags werden in der Regel entweder am N- oder am C-Terminus angebracht, um Störungen der Tertiärstruktur zu minimieren, die die Proteinfunktion verändern können. Oft kann eine Protease-Spaltstelle zwischen das rekombinante Protein und den Tag eingefügt werden, um den Tag nach der Aufreinigung proteolytisch zu dissoziieren.
Was sind Affinitäts-Tags?
Affinitäts-Tags werden an Proteine angehängt, um die Aufreinigung aus ihrer biologischen Quelle durch eine Affinitätstechnik zu erleichtern. Dazu gehören zum Beispiel Strep-Tag und AVI-Tag, die beide eine hohe Affinität zu Biotin haben. Die Bindung von Biotin an Streptavidin/Avidin ist eine der stärksten in der Natur bekannten nicht-kovalenten Wechselwirkungen.
Der Poly(His)-Tag ist ein weit verbreiteter Protein-Tag, der an zweiwertige Metallionen bindet, die auf Festphasenmatrices immobilisiert sind. His-getaggte Proteine haben eine erhöhte Polarität. Unter alkalischen Bedingungen chelatisieren die Histidinreste das Metallion und binden an den Träger.
Fusionsprotein-Tags
Einige Affinitäts-Tags wie Maltose-Bindungsprotein (MBP) oder Glutathion-S-Transferase (GST) sind keine kurzen AA-Sequenzen, sondern große Fusionsproteine. Diese haben neben der Aufreinigung eine doppelte Funktion als Solubilisierungsmittel. Sie sorgen für die korrekte Faltung von Proteinen, die in chaperonarmen Spezies wie E. coli exprimiert werden, und verhindern Ausfällungen.
| Tag | Sequenz | Matrix | Vorteile | Nachteile | Antikörper | GST | 211 AA | Glutathion | Unterstützt Faltung, stabilisiert Protein, Enzymaktivität erlaubt Ausbeuteabschätzung | Groß, nur Native Aufreinigung, nur N-Terminal | ABIN1573889 |
|---|---|---|---|---|---|
| MBP | 396 AA | Maltose | Unterstützt Faltung | Groß, nur native Aufreinigung | ABIN103913 |
| HIS | HHHHHH | Ni2+ | Tunable Affinitätsharz, arbeitet unter denaturierenden Bedingungen | Geladen, Empfindlichkeit (EDTA, DTT, Metalloproteine), Elutionsoptimierung | ABIN1573881 |
| AVI | GLNDIFEAQKIEWHE | Avidin | Hohe Spezifität, schonende Bedingungen | ABIN1574261 | |
| Strep | WAHPQPGG | Streptavidin | Hohe Spezifität, ungeladen, gute Aufreinigung, Ein-Schritt-Elution | Nur Native Aufreinigung | ABIN3181089 |
| StrepII | WSHPQFEK | Strep-Tactin | Hohe Spezifität, ungeladen, gute Aufreinigung, einstufige Elution | ABIN1573896 |
Was sind Epitop-Tags?
Epitop-Tags sind künstliche Epitope, die in frame mit der kodierenden Sequenz des interessierenden Proteins kloniert werden. Epitop-Tags bestehen typischerweise aus Aminosäuresequenzen von 10-15 Aminosäuren Länge. Aufgrund ihrer relativ geringen Größe haben sie praktisch keinen Einfluss auf die Struktur des resultierenden Fusionsproteins. Die meisten Epitop-Tags sind von viralen Genen abgeleitet, was ihre hohe Immunreaktivität erklärt. Diese Tags sind besonders nützlich für Western Blotting-, Immunfluoreszenz- und Immunpräzipitations-Experimente, finden aber auch bei der Antikörperaufreinigung Verwendung. Beispiele sind Myc-Tag, HA-Tag, Spot-Tag oder V5-Tag.
Der DYKDDDDK-Tag, auch bekannt als FLAG®-Tag, ist einer der spezifischsten Epitop-Tags, die künstlich hergestellt wurden. Die Struktur des FLAG-Tags wurde für die Kompatibilität mit den Proteinen, an die es gebunden ist, optimiert. Seine hydrophile Natur minimiert die Auswirkungen auf Funktion, Sekretion oder Transport des Fusionsproteins.
| Tag | Sequenz | Matrix | Pros | Kontra | Antikörper |
|---|---|---|---|---|---|
| HA | YPYDVPDYA | mAb | Geringe Interferenz mit der Proteinstruktur, Poly-HA-Tag erhöht die Bindungskapazität | Kann nicht in apoptotischen Zellen gereinigt werden | ABIN2443910 |
| Myc | CEQKLISEEDL | mAb | Geringe Beeinträchtigung der Proteinstruktur | Kann die Translokation von sekretorischen Proteinen beeinträchtigen | ABIN1573879 |
| V5 | GKPIPNPLLGLDST | mAb | Geringe Störung der Proteinstruktur | ABIN3181078 | |
| DYKDDDDK | DYKDDDDK | mAb | Geringe Interferenz mit der Proteinstruktur, hohe Spezifität, gute Aufreinigung | Begrenzte Bindungskapazität | ABIN99294 |
Referenzen
: "Overview of affinity tags for protein purification." in: Current protocols in protein science, Vol. 73, pp. 9.9.1-9.9.23, (2014) (PubMed).: "Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems." in: Applied microbiology and biotechnology, Vol. 60, Issue 5, pp. 523-33, (2003) (PubMed).
: "Affinity fusion strategies for detection, purification, and immobilization of recombinant proteins." in: Protein expression and purification, Vol. 11, Issue 1, pp. 1-16, (1997) (PubMed).
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: "Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design." in: Angewandte Chemie (International ed. in English), Vol. 51, Issue 43, pp. 10724-38, (2013) (PubMed).
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