Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) wird zur Messung von Antigen- oder Antikörperkonzentration verwendet. Ein Standard-ELISA erfordert fünf Arbeitsschritte:

1. Beschichten einer Microtiterplatte mit Antigen.
2. Blockieren aller ungebundenen Stellen, um falsch-positive Ergebnisse zu vermeiden.
3. Antikörper zugeben.li>
4. Für die indirekte Methode: sekundären, konjugierten Antikörper hinzugeben.
5. Farbreaktion eines Substrats, welche qualitativ oder quantitativ ausgewertet werden kann

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Vorteile einer ELISA

Einer der bedeutenden Vorteile der ELISA-Methode ist die Quantifizierbarkeit des Signals. Die Durchführung eines ELISA Kits erfordert zumindest einen Antikörper, um ein spezifisches Antigen zu detektieren oder das Vorhandensein eines weiteren Antikörpers. Die Probe mit einer unbekannten Menge Antigen wird auf einem Untergrund immobilisiert. Danach wird der Antikörper zur Detektion zugegeben und formt einen Komplex mit dem Antigen. Dieser Antikörper ist mit einem Enzym konjugiert (direkte ELISA Methode) und erlaubt, in dem letzten Arbeitsschritt, die Umsetzung eines Substrats in ein detektierbares Signal. Anstelle radioaktiven Materials, welches lange Zeit für die Detektion in Assays eingesetzt wurde, werden Enzyme für Farbreaktionen eingesetzt, die positive Resultate anzeigen.

Es gibt zwei hauptsächliche Variationen dieser Methode: ELISA] kann, wie beschrieben, das Vorhandensein eines Antigens detektieren (direkte Methode) oder an einen anderen Antikörper binden, der ein Antigen erkennt (indirekte Methode).

Direkte ELISA Methode

Wie in der Zusammenfassung oben erwähnt, erfolgt bei einem direkten ELISA das Markieren mit dem primären Antikörper. Microwellplatten werden mit dem Probenmaterial beschichtet, das das gesuchte Antigen enthält. Das binden des markierten Antikörper kann quantifiziert werden. Das direkte ELISA Verfahren ist schnell, da nur ein Antikörper angewendet werden muss. Probleme mit Kreuzreaktionen aufgrund unspezifischen Bindens werden weitestgehend vermieden. Nachteilig allerdings ist, dass für jedes Antigen ein passender Antikörper markiert werden muss, was zeitaufwändig ist. Ein weiterer Nachteil ist, dass die Signalstärke niedrige sein kann, ein Problem, das die indirekte ELISA Methode lösen kann.

Indirekte ELISA Methode

Diese ELISA Methode beinhaltet zwei Schritte. Zunächst bindet ein primärer Antikörper an das Antigen, dann erkennt ein markierter secondary antibody den ersten Antikörper. Ein Nachteil dieser ELISA Methode ist, dass es zu starken unspezifischen Hintergrundsignalen kommen kann. Vorteilhaft ist jedoch, dass es durch die Bindung mehrerer sekundärer Antikörper zu einer signalverstärkenden Wirkung kommt. Vor allem aber ist die größere Flexibilität von Vorteil gegenüber der direkten ELISA Methode. Primäre Antikörper können unmarkiert verwendet werden und wenige markierte sekundärer Antikörper reichen, um ein weites Spektrum an primären Antikörpern abzudecken.

Sandwich ELISA

Sandwichmethode misst die Menge Antigen zwischen zwei Lagen von Antikörpern. Sandwich ELISAs haben die Einschränkung, dass das Antigen mindestens zwei Antigenbindungsstellen besitzen muss, damit mindestens zwei verschiedene Antikörper binden können. Nützlich sind die Sandwich ELISAs jedoch, wenn die Konzentration des Antigens gering ist oder eine hohe Konzentration anderer Antigene eine Probe verschmutzen.

Um diesen ELISA Assay anzuwenden, wird ein sogenannter (Capture Antikörper) an einen Untergrund gebunden. Das Antigen wird hinzugefügt und bindet an diesen Fangantikörper. Ein zweiter primärer, unmarkierter Detektionsantikörper wird hinzugefügt. Das Antikörper Paar bindet an das Antigen – das Namensgebende Sandwich ist vollständig. Das Ergebnis kann quantifiziert werden, indem ein markierter sekundärer Antikörper hinzugefügt wird, der an den zweiten primären Antikörper bindet und die enzymatische Farbreaktion katalysiert. Vorteilhaft ist es, dass das Antigen nicht aufgereinigt werden muss, da die Methode hochspezifisch ist. Ein Nachteil ist es jedoch, dass nicht alle Antikörper für diese Methode verwendet werden können.

Kompetitiver ELISA

Ein unmarkierter Antikörper wird bei der kompetitiven ELISA an einen Untergrund gebunden (Microtiterplatte). Dieser primäre Antikörper wird dann jeweils mit unmarkierten Standards oder den zu messenden Proben inkubiert. Sobald diese Reaktion ihr Gleichgewicht erreicht hat, wird ein konjugiertes Antigen oder ein mit einem Enzym gebundener Antikörper hinzugefügt. Das Antigenkonjugat bindet den primären Antikörper überall dort, wo er nicht an unmarkiertes Antigen aus der Probe gebunden hat. Daraus folgt, je mehr Antigen in der Probe oder dem Standard vorhanden ist, desto weniger konjugiertes Antigen kann gebunden werden. Ein Substrat ergibt ein Farbreaktion die ausgemessen werden kann.

Der Vorteil der kompetitiven ELISA ist, dass nicht-aufgereinigter Antikörper verwendet werden kann. Im kompetitiven ELISA ist das Verhältnis zwischen der Konzentration des gesuchten Antigens und der Signalstärke umgekehrt proportional, d.h. je geringer die Signalstärke, desto größer die Menge gesuchten Proteins in der Probe.

Quantifizierung des Signals

Nach der Bindung des Antikörpers, beziehungsweise der Antikörper, wird eine normalerweise farbloses Reagenz zugegeben. Das Enzym spaltet das Reagenz und eine lösliche Farbe entsteht. Schon geringe Enzymmengen würden über einen längeren Zeitraum das vorhandene Reagenz komplett spalten. Alle Proben hätten dann die gleiche optische Dichte. Darum muss die Reaktion nach einer definierten Zeit, wenn gute Kontraste sichtbar sind, abgebrochen werden. Dazu wird das Enzym zerstört und man stoppt so die Farbreaktion. Dies geschieht beispielsweise durch Zugabe einer schwachen Säure. Danach wird die optische Dichte in einem Photometer bei der entsprechenden Wellenlänge gemessen.

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