Proximity Ligation Assay: Eine einfache Proteomik-Methode zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen

Interagieren Moleküle A und B?

Dies ist eine ganz einfache Frage, die in bestimmten Fällen zu einer sehr großen Herausforderung für den Zellbiologen werden kann. Herkömmliche Methoden zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen umfassen eine Vielzahl komplexer Experimente wie Two-Hybrid-Assays und Co-Immunpräzipitationen. Obwohl diese Versuche die Möglichkeit bieten, eine Interaktion zu analysieren, unterliegen sie allgemein bekannten und inhärenten Beschränkungen.

Beispielsweise erfordern Two-Hybrid-Assays zumeist eine exogene Expression der Zielfusionsproteine und weisen eine Interaktion nur unter künstlichen Bedingungen nach. Dagegen kann eine Co-Immunpräzipitation, die in vitro durchgeführt wird, zum Nachweis einer Interaktion zwischen endogen exprimierten nativen Proteinen (trotz des Vorhandenseins von Antikörpern) herangezogen werden, erfordert aber eine mittlere bis hohe Konzentration beider Zielproteine, damit ein effektives Auslesen erreicht werden kann.

Der Proximity Ligation Assay (PLA) ist ein weiteres sensibles, einfache zu nutzendes In-situ-Tool im „Werkzeugkasten“ des Forschers, das einen Einblick in die Protein-Protein-Interaktionen erlaubt.

Was ist ein Proximity Ligation Assay?

Ein Proximity Ligation Assay ist eine In-situ-Verbindung zwischen herkömmlichen antikörperbasierten Affinitätsproteomik-Methoden und moderner Molekularbiologie.

Prinzip des Proximity Ligation Assays:

• Ein Antikörperpaar erkennt und bindet an zwei potentiell interagierende Ziele.
• Diese Antikörper werden mit einem identischen Paar (Kennzeichnung +/-) von kurzen Einzelstrang-Oligonukleotiden konjugiert.
• Wenn die beiden Ziele interagieren und somit in unmittelbarer Nähe verbleiben, hybridisieren und binden die Oligonukleotidproben mit zwei zusätzlichen „Verbindungsoligonukleotiden“ und bilden eine ununterbrochene ringförmige DNA-Struktur.
• DNA-Polymerase-Enzyme synthetisieren weitere dieser ringförmigen Moleküle durch einfache, zuverlässige Rolling-Circle-Amplifizierung.

Das Ergebnis ist ein hoch amplifiziertes ringförmiges DNA-Molekül, das mit standardmäßigen Fluoreszenzmethoden nachgewiesen werden kann und das als qualitativer Marker für eine Interaktion zwischen den beiden Proteinen dient.

Warum ein PLA?

Es gibt keine Methode zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen, die allein einen absoluten Maßstab bietet. Jede Methode hat ihre eigenen Stärken und Grenzen. Forscher, die eine Protein-Protein-Interaktion untersuchen, führen häufig mehrere verschiedene verschiedene Experimente durch, um die gleiche Interaktion durch mehrere Methoden aufzuzeigen.

Der PLA ist ein attraktives Angebot zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen, denn er ist:

• Einfach - Proximity Ligation Assays setzen kein wochenlanges Klonieren oder eine Anordnungs- und Durchführungsoptimierung voraus. Sie verlangen lediglich die Verfügbarkeit von guten Sonden und guten Antikörpern.
• Empfindlich - Das Auslesen in einem Proximity Ligation Assay wird durch den Nachweis von amplifizierter DNA unterstützt. Aufgrund der exponentieller Natur der DNA-Amplifikation kann eine sehr begrenzte Anzahl von interagierenden Molekülen ein sehr starkes, kräftiges, sichtbares Signal erzeugen. Die Empfindlichkeit kann durch modulierende Amplifizierungsbedingungen abgestimmt werden (z. B. zusätzliche Zeit während der die Rolling-Circle-Amplifizierung stattfinden kann).
• In situ - Proximity Ligation Assays werden direkt in fixierten Zell- und Gewebeschnitten durchgeführt. Die Forscher können Interaktion zwischen nativen Proteinen unter nahezu natürlichen Bedingungen kennzeichnen. Der Proximity Ligation Assay verlangt nicht, dass Zellen zerstört oder Proteinanteile aus Gewebe entnommen werden, um Protein-Protein-Interaktionen nachzuweisen. Diverse Label und Tags können darin verwendet werden, um verschiedene Variablen gleichzeitig nachzuweisen.

Zusammenfassung

Der Proximity Ligation Assay ist eine einfache, qualitative Methode zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen in situ. Der Assay wurde auch genutzt, um posttranslationale Modifikationen wie eine Phosphorylierung nachzuweisen. Wird der PLA ordnungsgemäß mit einem genauen Verständnis der Stärken und Grenzen des Assays eingesetzt, bietet er ein weiteres leistungsstarkes Werkzeug für den Forscher, der ein umfassenderes Verständnis der intrazellulären Dynamik und Proteininteraktion erlangen möchte.